ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO PARA EL CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA

TABLA DE CONTENIDO:

1. OBJETIVOS

2. AGUA POTABLE

3. ANALISIS BACTERIOLOGICO

3.1 LIMITES PREMISIBLE PARA LAS AGUAS DE CONSUMO

3.2 METODOS DE ANALISIS-DETERMINACIÓN DE ESCHERICIA COLI MEDIANTE MEDIO EC-MUG,METODO DE TUBOS MULTIPLES

3.2.1 ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIÓN

3.2.2 PRINCIPIOS

3.2.3 REACTIVOS SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVOS

3.2.4 PROCEDIMIENTO

3.3 METODOS DE ANALISIS-DETERMINACIÓN DE ESCHERICIA COLI MEDIENTE MEDIANTE MEDIO EC-MUG COMO COMPLETO A LA NORMA CHILENA OFICIAL NCH 1620/2, DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES,METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA (FM)

3.3.1 ALCANCE Y CAMPOS DE APLICACIÓN

3.3.2 PRINCIPIOS

3.3.3 PROCEDIMIENTO

3.4 METODOS DE ANALISIS-DETERMINACIÓN DE TURBIEDAD POR METODO NEFELOMETRICO

3.4.1 ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIÓN

3.4.2 PRINCIPIOS

3.4.3 PROCEDIMIENTO

4. VIDEOS
5. BIBLIOGRAFIA

1. OBJETIVOS

Determinar los diferentes análisis bacteriológicos para la calidad del agua, conociendo los límites permisibles para el consumo del agua potable

2. AGUA POTABLE:

Significa que debe estar libre de microorganismos patógenos, de minerales y sustancias orgánicas que puedan producir efectos fisiológicos adversos. Debe ser estéticamente aceptable, por lo tanto, debe estar exenta de turbidez, color, olor y sabor desagradable. Puede ser ingerida o utilizada en el procesamiento de alimentos en cualquier cantidad, sin temor por efectos adversos sobre la salud (Borchardt and Walton, 1971).

Según el Art. 982 CAA (modificado por Resoluc. 494/94). Con las denominaciones de Agua potable de suministro público y agua potable de uso domiciliario, se entiende la que es apta para la alimentación y uso doméstico: no deberá contener sustancias o cuerpos extraños de origen biológico, orgánico, inorgánico o radiactivo en tenores tales que la hagan peligrosa para la salud.Deberá presentar sabor agradable y ser prácticamente incolora, inodora, límpida y transparente

Existe un grupo de enfermedades conocidas como enfermedades hídricas, pues su vía de transmisión se debe a la ingestión de agua contaminada. Es entonces conveniente la determinación de la calidad de la potabilidad desde el punto de vista bacteriológico. De gran importancia en el ámbito de la salud pública ya que permite garantizar la inocuidad del agua destinada al consumo evitando así epidemias gastrointestinales.

El agua destinada al consumo humano puede ser contaminada por las agua residuales o por desechos humanos y animales que pueden contener microorganismos patógenos (principalmente intestinales) como son los causantes de la tifoidea (Salmonella typhi), la disentería (Shigella dysenterieae) o el cólera (Vibrio cholerae) entre otros

Se ha buscado un método seguro para establecer la calidad higiénica de las aguas, método que se basa en la investigación de bacterias coliformes como indicadores de contaminación fecal.

Tabla 1:Principales enfermedades de origen hídrico y sus agentes responsables Enfermedad Agente

Origen bacteriano

ENFERMEDADES	AGENTES
Fiebres tifoideas y paratifoideas	Salmonella typhi Salmonella Paratyphi A y B
Disentería bacilar	shigella
colera	Vibrio cholerae
Gastroenteritis agudas y diarreas	Escherilla coli ET

Origen viral

ENFERMEDAD	AGENTE
Hepatitis A y E	Virus de la hepatitis Ay B
Poliomielitis	Virus del polio
Gastroenteritis agudas y diarreras	Virus Norwalk Rotavirus Astrovirus Calicivirus Enterovirus Adenovirus reovirus

Origen parasitario

ENFERMEDADES	AGENTES
Disentería amebiana	Entamoeba histolytica Guardia lambia Cristosporidium

• Toma de muestra:La muestra para análisis bacteriológico debe efectuarse con el mayor cuidado

• Envase:Se deben utilizar frascos esterilizados y con envoltura externa. La capacidad debe ser de 200 a 250 CC.

• Envío de muestras:Debe transcurrir el menor tiempo entre la extracción y la llegada al laboratorio, y que durante ese tiempo se mantenga entre 4 y 10 ºC. De lo contrario se producen modificaciones cuali-cuantitativas de la flora bacteriana.

• Toma de muestra de un grifo en una cañería de agua corriente:

1. Se elige un grifo que esté conectado directamente con una cañería de distribución, es decir, que el ramal del grifo no este comunicado con tanques domiciliarios, filtros, ablandadores u otros artefactos similares. Tampoco conviene extraer muestras de grifos colocados en puntos muertos de la cañería.

2. Estas precauciones no se tienen en cuenta cuando se desea conocer la calidad del agua que suministra un determinado grifo, en lugar de la que conduce la cañería principal.

3. Se quitan del grifo los dispositivos destinados a evitar salpicado. Luego se limpia la boca del grifo, cuidando de eliminar la suciedad que a veces se acumula en la parte interna del orificio. Después se deja salir agua en forma abundante durante 2 o 3 minutos y se cierra perfectamente el grifo para esterilizarlo.

4. Se esteriliza el grifo calentándolo durante un par de minutos con un hisopo embebido en alcohol.

5. Se abre con cuidado y se deja salir agua durante medio minuto en forma tal que el chorro no sea intenso y se llene el envase.

3. ANALISIS BACTERIOLOGICO

Características microbiológicas según Art. 982 del C.A.A. (modificado por resolución 494/94)

3.1 LIMITES PREMISIBLE PARA LAS AGUAS DE CONSUMO

Estos estudios bioquímicos analizan la presencia o ausencia de microorganismos que puedan contaminar el agua, haciéndola no apta para el consumo.

En el análisis bacteriológico de agua se investigan:

1. Bacterias mesófitas viables: en agar Plate Count 24 horas. A 37ºC, no más de 500UFC/ml

2. Bacterias coliformes: NMP a 37ºC – 48 hs. (Caldo Mc Conckey o Lauril Sulfato), en 100 ml; igual o menor a 3.

3. Ausencia de Escherichia coli: en 100 ml

4. Ausencia de Pseudomona aeruginosa: por 100 ml de muestra

3.2 MÉTODOS DE ANÁLISIS-DETERMINACIÓN DE ESCHERICIA COLI MEDIANTE MEDIO EC-MUG-DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES - MÉTODO DE TUBOS MÚLTIPLES (NMP).

3.2.1 ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIÓN

Este método de análisis establece una metodología para la verificación de Escherichia coli en aguas, a partir de los coliformes totales determinados por (NMP) mediante el método de los Tubos Múltiples. confirma la presencia/ausencia de Escherichia coli en el agua al traspasar un inóculo desde los tubos positivos de la etapa presuntiva en caldo Lauril sulfato triptosa o caldo Lactosado, a medio EC-MUG después de incubar a 44.5°C durante 24 horas o menos,es aplicable para verificar el cumplimiento del requisito de ausencia de Escherichia coli en agua potable, establecido en NCh 409/1 Of. 2005.

3.2.2 PRINCIPIOS

El método se basa en la capacidad que posee la enzima β-D-glucuronidasa presente en la bacteria E. coli, para hidrolizar el sustrato fluorogénico 4-metil umberiferil-β-D-glucuronido (MUG), liberando el fluorógeno, cuando crece en el medio EC-MUG a 44.5°C dentro de 24± 2 hr o menos.La fluorescencia es detectada por la aparición de una coloración azul brillante al aplicar luz ultravioleta de longitud de onda larga en la oscuridad, usando una lámpara de 4 W a 6 W.

3.2.3 REACTIVOS, SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO

Todos los reactivos deben ser de calidad para análisis.

Medios de cultivo: Medio EC-MUG:

Composición del medio de cultivo EC-MUG: Peptona de caseína 20.0 g, Lactosa 5.0 g, Mezcla de sales biliares o sales biliares Nº 3 1.5 g, Cloruro de sodio, NaCl 5.0 g, Fosfato dipotásico monohidrogenado, K2HPO4 4.0 g, Fosfato monopotásido dihidrogenado, KH2PO4 1.5 g, 4-metilumberiferil - β-D-glucuronido 0.05 g, Agua grado reactivo 1 L, pH 6.9 ± 0.2 a 25°C después de esterilizar 15 min a 121°C.

Preparación del medio de cultivo EC-MUG:El medio de cultivo deshidratado listo para uso, se encuentra en el mercado y se expende con certificación. Pesar la cantidad específica indicada en el frasco de medio EC-MUG, rehidratar sobre 1 L de agua para análisis grado reactivo clase 4. Agitar para disolver, calentar para total disolución, dispensar 10 mL en tubos de ensayo conteniendo tubos Durham en su interior, tapar y esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121°C.

3.2.4 PROCEDIMIENTO

Ensayo de las muestras.Las muestras de agua potable se analizan para estimar la concentración de coliformes totales según lo dispuesto en la norma chilena NCh 1620/1.Como complemento a la etapa anterior, se aplica el procedimiento de verificación en medio EC-MUG definido en este documento, para identificar la presencia/ausencia de Escherichia coli. Para ello, traspasar una asada de todos los tubos de fermentación positivos del ensayo presuntivo (NCh 1620/1) a tubos conteniendo medio EC-MUG.En caso de que existan tubos que presenten crecimiento sin producción de gas también deben ser traspasados a medio EC-MUG.Incubar en baño termoregulado a 44.5 ±0.2 °C por 24 horas. Colocar todos los tubos inoculados en EC-MUG en el baño termoregulado dentro de los 30 minutos desde su inoculación. Transcurrido el periodo de incubación retirar todos los tubos del baño termoregulado y desechar los que no presenten desarrollo bacteriano. Someter los tubos de EC-MUG que presenten crecimiento, bajo la lámpara de luz UV de onda larga (365-366 nm) en oscuridad y observar si se produce fluorescencia. Registrar como positivos a todos los tubos EC-MUG inoculados que presenten fluorescencia azul brillante.

3.3 MÉTODOS DE ANÁLISIS –DETERMINACIÓN DE ESCHERICIA COLI MEDIANTE MEDIO EC-MUG,COMO COMPLEMENTO A LA NORMA CHILENA OFICIAL NCH 1620/2: DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES: MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA (FM).

3.3.1 ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIÓN

Este método de análisis establece una metodología para la verificación de Escherichia coli en aguas, a partir de los coliformes totales determinados en medio m-Endo mediante la técnica de filtración por membrana (ver NCh 1620/2).confirma la presencia/ausencia de Escherichia coli en el agua al traspasar coloniasde coliformes totales típicas y atípicas desarrolladas en medio m-Endo, a medio EC-MUG dentro de 24 horas o menos,es aplicable para verificar el cumplimiento del requisito de ausencia de Escherichia coli en agua potable establecido en NCh 409/1 Of. 2005.

3.3.2 PRINCIPIOS

El método se basa en la capacidad que posee la enzima β-D-glucuronidasa presente en la bacteria E. coli, para hidrolizar el sustrato fluorogénico 4-metil umberiferil-β-D-glucuronido (MUG),Liberando el fluorógeno, cuando crece en el medio EC-MUG a 44.5°C dentro de 24± 2 hr. , o menos.La fluorescencia es detectada por la aparición de una coloración azul brillante al aplicar luz ultravioleta de longitud de onda larga en la oscuridad, usando una lámpara de 4 W a 6 W.

3.3.3 PROCEDIMIENTO

Ensayo de las muestras:Las muestras de agua potable se analizan para determinar la cuantificación de coliformes totales según lo dispuesto en la norma chilena NCh 1620/2.Como complemento a la etapa anterior, se aplica el procedimiento de verificación en medio EC-MUG definido en este documento, para identificar la presencia/ausencia de Escherichia coli. Para ello, traspasar desde la membrana mediante un asa de aguja y por separado, a lo menos 5 colonias aisladas típicas (rosadas a rojo oscuro con brillo metálico superficial) y 5 colonias atípicas (rojo oscuro, mucosas o nucleadas sin brillo), a tubos conteniendo medio EC-MUG.En caso que el desarrollo bacteriano sobre la membrana sea inferior al número de colonias típicas y/o atípicas indicadas en el punto anterior, se deberán traspasar todas las colonias de cada tipo.Incubar en baño termorregulado a 44.5 ± 0.2 °C por 24 horas. Colocar todos los tubosinoculados en EC-MUG en el baño termoregulado dentro de los 30 minutos desde su inoculación.Transcurrido el periodo de incubación retirar todos los tubos del baño y desechar los que No presenten desarrollo bacteriano.Someter los tubos de EC-MUG que presenten crecimiento, bajo la lámpara de luz UV de onda larga (365-366 nm) en la oscuridad y observar si se produce fluorescencia.Registrar como positivos a todos las tubos EC-MUG inoculados con colonias típicas y atípicas aisladas, que presenten fluorescencia azul brillante.

3.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS –DETERMINACIÓN DE TURBIEDAD POR MÉTODO NEFELOMÉTRICO.

3.4.1 ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIÓN

Este método de ensayo establece la metodología para el análisis de turbiedad en aguas mediante nefelometría. Este método, es aplicable para la determinación de turbiedad, según lo establecido en la norma NCh 409/1- Of. 2005.

3.4.2 PRINCIPIOS

El método se basa en la comparación instrumental de la intensidad de la luz dispersada por una muestra problema y la intensidad de la luz dispersada por una muestra patrón de referencia, bajo las mismas condiciones. Se utiliza como patrón de referencia, el polímero "Formazina", cuya turbiedad a una concentración específica, se define como 4000 UNT (unidades nefolométricas de turbiedad).

3.4.3 PROCEDIMIENTO

Ensayo de las muestras. Ajuste y calibración del instrumento, Verificar calibración del instrumento siempre antes de cada uso. Seguir rigurosamente las condiciones de operación proporcionadas por el fabricante del equipo. Como práctica de rutina verificar el instrumento con patrones secundarios o suspensiones diluidas de turbiedad, en todo el rango de trabajo de cada equipo en particular. Chequear periódicamente la calibración completa, en toda la escala del turbidímetro, con suspensión estándar primaria de Formazina. La frecuencia recomendada es una vez al mes o cuando la verificación con patrones secundarios así lo indique.

Análisis de las muestras: Una vez verificada la calibración de instrumento, proceder a la medición de las muestras. Para ello seguir el protocolo de operación establecido en el manual de operaciones del instrumento. Agitar suavemente la muestra para homogeneizar y dispersar los sólidos. Evitar en lo posible la dilución de las muestras. Esperar hasta que desaparezcan las burbujas de aire u otros gases atrapados en la muestra. Este tiempo de reposo debe ser mínimo, ya que se puede producir sedimentación de partículas y cambios en la temperatura de la muestra, que pueden dar lugar a una medición no representativa. Transferir una fracción de muestra hacia la celda de medición. Limpiar minuciosamente la pared externa de la celda con un paño suave embebido de aceite siliconizado, hasta que no se observe ninguna huella digital o suciedad. Introducir la celda de lectura en el turbidímetro en la posición exacta señalada para cada instrumento y leer el valor de turbiedad directamente.

4. VIDEOS

VIDEO 1: